Rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych

Kiedy wynaleziono mikroskopy około 1600 rpne, naturalni filozofowie zwrócili wzrok na świat w świecie. Kiedy Antony van Leeuwenhoek wykonał małe, wysoko zakrzywione soczewki i mechaniczny uchwyt do regulacji widoku, otworzył okno na mikroskopijny świat bakterii, komórek krwi, pierwotniaków i struktury komórkowej roślin. Ale w historii mikroskopii zawsze było jedno pytanie: jakie są te dziwne rzeczy widziane przez obiektyw? Mikroskopia fluorescencyjna odnosi się do zestawu technik, które minimalizują tę niepewność - ponieważ w mikroskopii fluorescencyjnej, gdy światło jest naświetlane na próbce, świeci ono własnym światłem z powrotem.

Epifluorescencja
Zdecydowanie Najczęstszym mikroskopem fluorescencyjnym jest konfiguracja epifluorescencji. W mikroskopie epifluorescencyjnym źródło światła - zazwyczaj lampa rtęciowa lub ksenonowa - świeci przez filtr, który wybiera wąski obszar długości fal. Odfiltrowane światło świeci na próbkę przez soczewkę obiektywu mikroskopu. Przychodzące światło jest pochłaniane przez fluorofory - molekularne etykiety emitujące światło o dużej długości fali, gdy absorbują światło o krótszej długości fali. Światło z fluoroforów wraz z rozproszonym światłem ze źródła oświetlenia wraca do soczewki obiektywu i do detektora lub oka. Po drodze kolejny filtr blokuje światło iluminacyjne, więc pozostaje tylko światło fluorescencyjne z próbki.

Konfokalny
Mikroskop epifluorescencyjny zbiera światło z dowolnego miejsca w polu widzenia mikroskopu . Część światła wzbudzającego jest pochłaniana przed płaszczyzną ogniskową mikroskopu, część w płaszczyźnie ogniskowej, a część poza płaszczyzną ogniskowania. Ponieważ mikroskop zbiera całe to światło, obraz będzie zawierał ostry obraz światła na ognisku, ale będzie także miał nieostre światło z innych regionów. Mikroskop konfokalny rozwiązuje ten problem, skupiając plamkę lasera w tej samej płaszczyźnie, na której koncentruje się mikroskop. Następnie dziurka idzie przed detektor, gdzie blokuje całe światło, które nie pochodzi z ogniska mikroskopu. Skanując próbkę, można uzyskać czysty trójwymiarowy obraz obiektu.

Multiphoton
W mikroskopie konfokalnym wyrównanie jest bardzo czułe. Jeśli plamka lasera, cel mikroskopu, optyka zbierająca i dziurka nie są w najmniejszym stopniu narażone na działanie mikroskopu. Mikroskop wielofotonowy omija ten problem, wykorzystując długość fali lasera, która jest tylko w połowie tak energetyczna, jak musi być, aby wzbudzić fluorofory w próbce. Jedynym sposobem, w jaki fluorofory będą wzbudzać i emitować fluorescencję, jest to, że światło lasera jest wystarczająco jasne, aby dwie cząstki światła - fotony - uderzyły w fluorofor w bardzo krótkim czasie. Dzieje się tak tylko wtedy, gdy laser jest skupiony w bardzo małym miejscu. Jedynym miejscem w próbce, które emituje światło, jest miejsce skupienia lasera, dzięki czemu obraz jest ładny i czysty, ponieważ nie ma dodatkowego światła tła, którego można by się pozbyć - co oznacza brak otworu do wyrównania.

Całkowita fluorescencja wewnętrznego odbicia (TIRF)
Innym sposobem uzyskania bardzo czystych obrazów jest upewnienie się, że światło wzbudzenia nie dociera bardzo daleko do próbki. Jeśli kropelka neuronów zostanie na przykład umieszczona w kropli roztworu na szkiełku, niektóre neurony przylegają do powierzchni szkła. W mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) światło jest kierowane bokiem do szkiełka, tak że tak naprawdę nie trafia do roztworu zawierającego komórki. Ale część światła ledwo przecieka do roztworu - tuż przy powierzchni szkła. Oznacza to, że jedyne miejsca, które będą emitować światło, znajdą się w bardzo cienkim obszarze przy powierzchni szkła. Dla czegoś takiego jak neurony, gdzie na powierzchni komórek dzieje się tak wiele interesujących rzeczy, ta technika może być bardzo skuteczna.

Super-rozdzielczość
Wszystkie mikroskopy - w tym mikroskopy fluorescencyjne - są ograniczone przez fizyka, która reguluje propagację światła. Jedną z podstawowych zasad jest to, że skupiona plamka światła może stać się tak mała - i nie mniejsza. W przypadku światła widzialnego rozmiar ten wynosi około 200 nanometrów lub 200 miliardów metra. Ale pojedyncze cząsteczki mają tylko kilka nanometrów, więc istnieje wiele interesujących cech, które są poniżej tego limitu wielkości, zwanego granicą dyfrakcji. Naukowcy opracowują techniki „super-rozdzielczości”, aby przemycić ten limit. Na przykład mikroskopia z oświetleniem strukturalnym (SIM) i mikroskopia z pobudzaniem emisji stymulowanej (STED) są metodami mikroskopii fluorescencyjnej, które ograniczają wielkość emitującego światło miejsca przez zmniejszenie rozmiaru punktu światła wzbudzenia.

URL:https://pl.whycomputer.com/sprzet/100307040.html